10月7日晚間消息，2019年度的諾貝爾生理學或醫(yī)學獎已經宣布，今年的獎項授予兩位美國科學家和一位英國科學家：授予威廉·凱林（William G。 Kaelin），彼得·拉特克利夫爵士（Sir Peter J。 Ratcliffe）以及格雷格·薩門扎（Gregg L。 Semenza），以表彰他們在“生物在分子層面上如何感知氧氣”方面所作出的開創(chuàng)性貢獻。

細胞是如何感知氧氣的？

自從現(xiàn)代生物學的伊始，人們就知道生命的維持需要氧氣，但是生物細胞是如何做出調整以適應不同的氧氣供應環(huán)境的？其背后的分子機制究竟是什么？這兩個問題卻一直未能被很好的理解，直到今年的幾位諾貝爾獎獲獎人所做的工作闡明了這一機制。

當周圍的氧氣水平發(fā)生變化時，動物細胞會經歷基因表達上的明顯改變。這種基因表達上的改變會同時改變細胞新陳代謝，組織重塑，甚至組織反應，比如心率加速，或者呼吸量的改變。

在1990年代早期的研究中，格雷格·薩門扎最早識別，并于此后在1995年最終提純并克隆了一種轉錄因子，其對這些與氧氣密切相關的反應機制起到調節(jié)作用。他將這一因子命名為HIF，即“缺氧誘導因子”，并確認其包含兩個部分：一種是全新發(fā)現(xiàn)的，對氧氣敏感的HIF-1a，另一種是此前就已經被發(fā)現(xiàn)的，固有性表達，并且并不受氧氣調節(jié)的蛋白質“ARNT”。1995年，威廉·凱林正在從事馮·希佩爾-林道腫瘤抑制基因的研究并成功實現(xiàn)了對該基因的全序列分離與克隆，他發(fā)現(xiàn)，這種基因可以抑制VHL突變致癌細胞系中的腫瘤生長。

隨后，在1999年，彼得·拉特克利夫證明了，VHL 與HIF1a之間存在某種關聯(lián)，并發(fā)現(xiàn)VHL可以調節(jié)HIF-1a的翻譯后及氧敏降解。最后，凱林和拉特克利夫的研究團隊同時證明了這種VHL對于HIF-1a的調節(jié)機制會受到HIF-1a羥基化的影響，這是一種共價修飾，其本身將受到氧氣水平高低的影響。

由于以上這三位獲獎人的工作，證明了由于氧氣水平改變引發(fā)的基因表達反應，與動物細胞內的氧氣水平之間存在直接耦合關系，從而允許透過HIF轉錄因子的作用，實現(xiàn)對于氧化反應的快速細胞層面響應。

氧氣與動物生命

在1770年代，瑞典科學家卡爾·舍勒（Carl Scheele）通過計算得到結論，空氣中大約有1/4的體積是所謂的“feuer luft”，即他所稱的“火氣”，也就是可以支持物體發(fā)生燃燒的氣體。這一發(fā)現(xiàn)的相關論文最終于1777年公開發(fā)表（Scheele，1777）。大約與此同時，在英國，約瑟夫·普里斯特利（Joseph Priestley）也發(fā)現(xiàn)了一種方法來提純這種此前未知的氣體，并將其稱之為“去燃素空氣”（Priestley， 1775）。而除了舍勒和普里斯特利之外，大致同一時間，法國化學家安托萬·拉瓦錫（Antoine Lavoisier）也在巴黎進行了對這種氣體的分離試驗，并且也對其進行了自己的命名。而這個命名也正是這種氣體在今天被廣為接受的名稱：氧氣 （Lavoisier， 1777）。

動物生命離不開氧氣，因為我們的身體需要借助氧化反應驅動將營養(yǎng)物質轉化為ATP。事實上，根據可獲得的氧氣數量來調節(jié)細胞活動，正是新陳代謝調節(jié)的關鍵內容之一。早在一個多世紀之前我們就已經明白這個道理，比如在1858年，法國微生物學家路易斯·巴斯德（Louis Pasteur）最先證明在動物細胞內存在復雜的氧氣使用平衡，并證明細胞會透過多條復雜路徑來完成能量轉換（Pasteur， 1858）。

而關于動物體內對氧氣的感知機制，此前已經獲得過兩次諾貝爾獎，一次是1931年授予德國生理學家奧拓·沃伯格（Otto Warburg），其成就是發(fā)現(xiàn)了細胞呼吸的酶基礎，第二次是1938年授予比利時醫(yī)學家柯奈爾?海門斯（Corneille Heymans），獎勵其在神經系統(tǒng)在機體對氧氣的呼吸反應中所發(fā)揮的作用方面進行的研究。然而，在整個20世紀的大部分時間里，我們仍然不清楚，對于氧氣水平變化的調節(jié)機制，是如何在基因表達的基礎水平上得到調節(jié)的。

對不同氧氣水平的適應

對于絕大部分動物體內的細胞而言，能夠對氧氣水平的變化做出快速相應是非常關鍵的。分子分類學已經清楚表明，在生物演化過程中，隨著動物細胞開始聚集到一起，組成多細胞的三維結構體生命開始，這種對于氧氣水平的響應能力便不再僅僅是一種細胞層面的，用作調節(jié)單個細胞內部新陳代謝水平的反應，而且還發(fā)展出了一套復雜的生理反應機制。細胞需要作出許多自動反應，以對變化的氧氣供應水平作出反應，其中尤為重要的是對自身的新陳代謝水平進行調節(jié)。

當在組織和器官層面觀察這種反應時，我們發(fā)現(xiàn)多細胞組織不僅需要重塑自身組織以適應變化后的氧氣環(huán)境（比如在受傷之后重構血管系統(tǒng)），還需要調動整個組織以補償氧化水平的變化（比如劇烈運動后，或者暴露于高海拔地區(qū)時，人的呼吸會變得急促）。

作為一個案例：生活在高海拔地區(qū)的人們，其體內的氧氣水平變化是由其腎臟內的一種特殊細胞負責感知的，其可以分泌并釋放一類名為“紅細胞生成素”（EPO）的荷爾蒙。這種荷爾蒙會激活骨髓中的血紅細胞合成。促發(fā)這一反應的一種方式是暴露于高海拔地區(qū)的低氧環(huán)境下，在這樣的環(huán)境中，腎臟的EPO生成速度將加速，從而導致血液內紅細胞含量升高，從而幫助我們的身體更好適應高海拔地區(qū)的低氧環(huán)境。

動物可以暴露于低氧環(huán)境，但有一點很重要，氧氣水平在身體組織內部也會出現(xiàn)起伏波動。動物機體組織內部的氧氣水平會出現(xiàn)空間和時間上的變化，而這種變化在正常生理事件中也會頻繁發(fā)生，比如運動過后骨骼肌的缺氧，但也會在病理過程中出現(xiàn)，比如癌癥和感染。而通過上世紀1970~1980年代期間的相關工作，事情逐漸變得明朗：這些局部和暫時性的氧氣水平改變會通過基因表達的形式，激發(fā)細胞和組織層面的關鍵性適應反應。

這些基因調節(jié)反應將會改變細胞新陳代謝，并控制基礎性發(fā)育，再生和機體防御機制，包括血管形成，發(fā)炎等。

動物細胞感知不同氧氣水平的能力，以及隨之改變自身基因表達的機制，對于機體的生存至關重要。這種氧氣驅動的信號通路至少影響著300個不同的基因，它們分屬于多個不同的機體調節(jié)系統(tǒng)。

這些分子水平上的通路廣泛參與多種生理過程，從器官發(fā)育到代謝平衡再到組織再生和免疫功能，并在許多疾病的進展中起到關鍵性作用，其中包括癌癥。

氧氣與紅細胞生成

生物體內的任何關鍵性信號通路，幾乎肯定會與不同層面上的大量其他分子通路之間存在相互關聯(lián)。氧氣響應通路也不例外。因此，正如預料的那樣，今年獲得諾貝爾生理學或醫(yī)學獎的這些基礎性工作，并未終結在分子層面氧氣響應機制方面的研究，與此相反，這些關鍵性發(fā)現(xiàn)開啟了一個嶄新領域，激發(fā)大量研究人員投入其中，取得大量研究成果，揭示出分子層面對氧氣響應機制的極度復雜性。

今年的三位獲獎人：威廉·凱林，彼得·拉特克利夫以及格雷格·薩門扎所取得的基礎性發(fā)現(xiàn)，都是圍繞缺氧誘導因子（HIF）的作用所展開的。這一因子的發(fā)現(xiàn)，最早需要追溯到在1986年至1987年間多位研究人員所做的工作，其中包括莫里斯·邦杜倫特（Maurice Bondurant），馬克·克里（Mark Koury）以及賈米·卡羅（Jaime Caro）等；他們的工作表明低氧環(huán)境會促發(fā)腎臟內紅細胞生成素（EPO）荷爾蒙的轉錄表達（Bondurant and Koury， 1986； Jelkmann and Hellwig-Burgel， 2001；Schuster et al。， 1987）

這項發(fā)現(xiàn)反過來，植根于1882年開展的相關實驗，以及法國生理學家保羅·博特（Paul Bert）的相關工作（Bert， 1878），他在1878年最先證明了低氧環(huán)境對于心血管產生的效應，也是首位發(fā)現(xiàn)暴露于高海拔環(huán)境下，會導致生物體內紅細胞數量增加的科學家（Bert， 1882）。

HIF的分離

在發(fā)現(xiàn)EPO基因表現(xiàn)出缺氧誘導的轉錄反應之后，下一步就是確定EPO基因調控區(qū)域中負責氧敏感性的DNA序列。薩門扎決定在轉基因小鼠身上追蹤EPO基因的轉錄調控因子，他使用的是包含人類EPO基因的不同大小的DNA片段克隆。薩門扎和同事們首先闡明了一個覆蓋了EPO編碼序列的區(qū)域，包含了4000個堿基，以及一些小的5 ‘和3 ’側翼序列，這些序列會導致所有被分析的轉基因組織產生EPO，并導致循環(huán)的EPO水平升高，從而產生紅血球增多癥，即紅細胞的計數增加。接下來，薩門扎證明了一個更長的EPO基因結構，包含6000個堿基的5’側翼DNA序列，能夠在腎臟中誘導EPO表達。這項工作指向了一個EPO對氧反應的轉錄調控復合體，包括正調控和負調控因子。

一年后的1991年，薩門扎在另兩項研究中，增加了調節(jié)EPO基因的重要信息：1）一項脫氧核糖核酸酶（DNAse）過敏癥研究發(fā)現(xiàn)，EPO 3 ‘側翼DNA的一小塊區(qū)域結合了幾個核因子，其中至少有兩個因子是由肝臟和腎臟貧血誘導的；這個小區(qū)域能夠作為缺氧誘導的增強子，在體外瞬時表達測定中發(fā)揮作用；2）進一步研究了EPO在轉基因模型中的轉錄調控。大約在同一時間，彼得·拉特克利夫爵士和賈米·卡羅實驗室報告稱，EPO基因中存在一個具有順式作用的DNA 3’元件，在轉染到體外培養(yǎng)的肝癌細胞中，該元件賦予了報告基因對氧的響應性。

上述工作使薩門扎于1992年在EPO基因的3 ‘端發(fā)現(xiàn)了約50個堿基對的增強子，可用于誘導缺氧誘導型報告基因在培養(yǎng)細胞中的表達。這種增強子被薩門扎稱為缺氧反應元件（HRE），它結合了肝癌細胞中的幾個核因子：一個是本身結構，另一個是缺氧誘導的。后者因此被薩門扎稱為低氧誘導因子（HIF）。

拉特克利夫和薩門扎都證明，EPO基因的3’增強子可以在多種哺乳動物細胞類型中驅動缺氧誘導型報告基因表達。這表明，參與EPO基因氧調節(jié)的分子機制在多種動物細胞中都很活躍的，HIF因此也很可能是常見的氧感知細胞機制的一部分。

低氧誘導HIF可以在多種哺乳動物細胞中觀察到，不僅僅是腎臟和肝臟中產生EPO的細胞。這一觀點引起了更廣泛的科學家群體的興趣和關注。HIF的發(fā)現(xiàn)表明了一種潛在的，普遍存在于代謝適應基礎上的分子機制，并在組織氧通量的作用下誘導組織重塑。

此時，薩門扎采用生化方法從大量的細胞提取物中純化HIF蛋白質。在純化過程中進行功能分析時，他使用了應用于EPO基因3’增強子的電泳遷移率轉移（EMSA）實驗。氨基酸測序和隨后對純化蛋白質的cDNA克隆表明，HIF本身是一個異源二聚體，由兩個不同的基因產物組成。第一個組件是對氧敏感的部分，稱為HIF-1α；第二個組件是一種結構性表達的基因，最初被稱為HIF-1b。后來，更多的研究對HIF-1b進行了克隆和描述，并稱其為芳香烴受體核轉位子（ARNT）。ARNT蛋白和其他一些因子會形成異二聚物，而且它的表達并不會對氧含量敏感，因此顯而易見，HIF-1α才是復合體中氧響應性的調節(jié)者。

HIF家族的擴大

有四個研究小組獨立克隆出了一個與HIF-1α高度相關的蛋白質，即Yoshiaki Fujii-Kuriyama、Werner Risau、Christopher Bradfield和Steven McKnight的團隊。他們的研究都是在1997年完成的。編碼該蛋白質的基因最初有許多名稱，包括仍然很常用的“HIF-2a”。不過，該基因恰當的名稱是EPAS1。EPAS1基因編碼的蛋白質與HIF-1α具有高度的序列同源性，并且也能結合ARNT異質二聚體。它與HIF-1α一樣，都對缺氧敏感，并且?guī)缀蹙哂泻虷IF-1α同樣的調節(jié)功能。

然而， HIF-1α和EPAS1之間也存在顯著的功能差異。HIF-1α基因缺失的小鼠出現(xiàn)了一個明確的表型，即中期妊娠致死性；而Epas1基因缺失則具有高度變化的表型，可能是遺傳背景的變化造成的。此外，有大量證據表明，某些缺氧反應僅由某種對氧敏感的HIF同等型專一控制，例如，紅細胞生成似乎就主要由EPAS1控制。

HIF的調節(jié)發(fā)生在轉譯之后，且涉及VHL

由多個實驗室（包括拉特克利夫所在的實驗室在內）收集的數據顯示，HIF-1a水平本身受蛋白質穩(wěn)定性的變化調節(jié)、而非受基因轉錄或蛋白質合成的變化調節(jié)。許多團隊隨后進一步發(fā)現(xiàn)，HIF-1a會通過“泛素-蛋白酶體”通路降解，且該過程依賴于氧氣。該研究還確定了HIF-1a中負責這類降解的特定結構區(qū)域（名為ODD區(qū)域，即“依賴于氧氣的降解”的英文縮寫，在HIF-1a和EPAS1中均存在）。

大約在同一時期，1995年，凱林的團隊首次發(fā)表了VHL腫瘤抑制基因的完整序列，并指出若向腎細胞癌細胞株中重新引入一種野生型VHL，便可阻止該細胞株形成腫瘤。凱林和其它多支研究團隊一直在研究VHL基因、以及該基因與一系列對特定癌癥具有遺傳易感性的基因家族的聯(lián)系。凱林發(fā)表的論文中指出，VHL是一種腫瘤抑制基因，其活動能夠抑制VHL基因變異的患者體內的腫瘤細胞生長。1996年，在確定VHL基因特性的過程中，凱林的團隊與馬克·戈德伯格團隊間的合作研究顯示，VHL變異細胞株中有許多HIF目標基因存在過度表達。這一發(fā)現(xiàn)說明，“HIF應答”與“VHL相關腫瘤生長”兩條通路之間可能存在一定聯(lián)系。

而在尋找能夠與VHL蛋白質結合的物質時，研究人員發(fā)現(xiàn)了與VHL功能有關的一條重要線索。1995年，理查德·克勞斯納與同事們、以及凱林所在的團隊發(fā)現(xiàn)，VHL會與轉錄延伸因子B和C發(fā)生相互作用。1997年，克勞斯納、W·馬斯頓·萊恩漢和同事們發(fā)現(xiàn)，VHL存在于一種與Cul-2蛋白質構成的復合體中，這是蛋白質泛化中涉及的一種因子。該研究發(fā)現(xiàn)隨后被凱林成功復制。由于延伸因子C和Cul-2蛋白質的結構類似于Skp1和Cdc53（這兩種因子都會使特定蛋白質在泛素作用下發(fā)生水解），這說明VHL與蛋白質降解之間或具有某種聯(lián)系。

HIF以泛素化和被VHL水解為目標

盡管研究人員在1996至1998年間弄清了HIF-1a和EPAS1在常氧狀態(tài)下、會通過蛋白酶體降解被迅速消除，但仍不清楚該過程在缺氧狀態(tài)下是如何受到抑制的。這里缺失的一塊拼圖便是泛素E3連接酶，研究人員懷疑該物質與將HIF-1a確定為降解目標有關。而在這一點上，拉克利夫和同事們在1999年取得了關鍵性突破：他們在論文中指出，VHL復合體參與了HIF-1a的水解過程。他們和其他研究人員隨后提出，VHL在這一過程中起到了識別泛素E3連接酶的作用。

此時，整幅“拼圖”還缺少關鍵的一塊：VHL與HIF-1a之間的相互作用、以及后續(xù)的HIF-1a降解究竟是如何受氧氣調節(jié)的？麥克斯維爾等人在1999年發(fā)表的論文中指出，VHL與HIF-1a之間的相互作用既依賴于氧氣、又依賴于鐵。這一發(fā)現(xiàn)促使研究人員展開了對相關機制的搜尋：既要尋找HIF-1a依賴于氧氣發(fā)生的、使之能夠與VHL相結合的化學變化，又要尋找能夠催化該反應的酶。

此時研究人員已經了解到，膠原蛋白中會發(fā)生依賴于氧氣的蛋白質羥基化，且該反應可由膠原脯氨酸-4-羥化酶調節(jié)。因此研究人員猜測，HIF-1a中殘余脯氨酸依賴于氧氣發(fā)生的羥基化或許能產生與VHL相結合所需的構象變化。這一猜測隨后果然得到了證實。2001年，拉克利夫和凱林所在的實驗室同時報告稱，HIF-1a中ODD區(qū)域內部的兩種脯氨酸殘余物依賴于氧氣發(fā)生的4-羥基化增強了HIF轉錄因子中VHL復合體結合的親和性。描述該現(xiàn)象的兩篇論文在2001年以“背靠背”的形式發(fā)表。

氧依賴性的開關

脯氨酸羥基化需要氧氣，由此科學家揭示了HIF-1α和EPAS1蛋白質的翻譯后調控機制：在缺氧的情況下，羥基化不可能發(fā)生，VHL無法識別HIF-1α；正因為如此，HIF-1α不會泛素化，從而避免了被蛋白酶體降解，依然完好無損。HIF-1α逐漸積累，并激活了低氧誘導基因α的程序（圖1）。

拉特克利夫團隊和 McKnight團隊獨立確定了參與HIF-1α和EPAS1羥基化的脯氨酸羥化酶（PHD）基因。他們的論文描述了PHD基因的分離，都發(fā)表于2001年。凱林的團隊還用生化方法分離了PHD基因，并在2002年發(fā)表了這項研究。這些羥化酶的發(fā)現(xiàn)為制造特殊的PHD抑制劑，進而提高HIF活性提供了可能。例如，我們或許可以通過這種方法增加貧血患者的紅細胞生成素（EPO）水平。

第二個氧依賴性機制發(fā)現(xiàn)于2001年，與HIF-1α的降解無關，而是為了抑制HIF-1α作為轉錄因子的活動。薩門扎的團隊率先識別出了相關因子，稱為FIH-1（意為“抑制HIF的因子”）。FIH是一種氧依賴性的羥化酶，可以使HIF-1α和EPAS1氨基端激活域的天冬酰胺殘基（NTAD）羥基化。Murray Whitelaw和Richard Bruick發(fā)現(xiàn)，這種羥基化作用會干擾p300轉錄輔助激活因子的增加。因此，通過脯氨酸羥化過程，氧氣不僅促進了HIF-1α降解，還可以抑制任何逃脫VHL依賴性降解的HIF-1α或EPAS1的轉錄功能。因此，HIF-1α活性的氧依賴性翻譯后抑制具有兩個獨立的機制。這表明，保持合理的HIF水平，以及準確地調節(jié)細胞氧含量是一個非常精細的過程。

HIF調控途徑的廣泛意義

在氧依賴性機制發(fā)現(xiàn)之后，許多研究小組的工作揭示了HIF通路的穩(wěn)固性，以及HIF在調節(jié)受氧影響的基因表達中的核心作用。從發(fā)現(xiàn)最初的線索以來，薩門扎、拉特克利夫和凱林一直是該領域的中心人物。他們參與了進一步闡明HIF通路的分子生物學工作，并使我們更深刻理解了缺氧反應在健康狀態(tài)和疾病中的生理作用。

脯氨酸羥化酶的發(fā)現(xiàn)啟發(fā)了尋找羥化酶抑制劑，以提高HIF水平的研究，為藥理學開發(fā)開辟了新的途徑。事實上，一些通過抑制脯氨酸羥化酶來增加HIF功能的潛在藥物已經進行了很長時間的臨床試驗，最近的一系列成果也展示了這些藥物在貧血治療中的臨床療效。

抑制HIF通路的未來應用也很有前景。我們或許可以用這些手段來減緩由VHL突變引起的某些癌癥的發(fā)展。其中之一是EPAS1功能的特異性阻滯劑，最近凱林和同事在動物模型中發(fā)現(xiàn)，該阻滯劑能夠減緩VHL突變細胞的腫瘤生長。

從藥理上提高HIF的功能可能有助于治療多種疾病，因為已有研究證明，HIF對免疫功能、軟骨形成和傷口愈合等多種現(xiàn)象至關重要。另一方面，抑制HIF功能也可以有許多應用：許多癌癥以及一些心血管疾?。òㄖ酗L、心臟病和肺動脈高血壓）中都會出現(xiàn)HIF水平升高。這些諾貝爾獎成果的應用很可能才剛剛開始，因為很明顯，細胞、組織和有機體對氧氣的反應是動物最核心、最重要的生理適應之一。