超分辨率熒光顯微成像技術在生命科學領域有著廣泛的應用，但在活細胞成像時也面臨著一系列挑戰(zhàn)。北京大學陳良怡教授團隊與哈爾濱工業(yè)大學李浩宇教授團隊合作提出稀疏解卷積算法，克服熒光顯微鏡的物理分辨率極限，實現(xiàn)通用的分辨率提升。該算法在活細胞成像應用與實踐過程中，實現(xiàn)了約60納米空間分辨率的毫秒曝光或者多色、三維、長時間的超分辨率熒光顯微成像，同時該算法還能與現(xiàn)有多數(shù)商業(yè)熒光顯微鏡結合應用，可謂是實現(xiàn)活細胞超分辨率熒光顯微成像的“新利器”。

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現(xiàn)代科技和生物醫(yī)學的交叉融合推動著臨床醫(yī)學的理念革新和技術進步。光學顯微鏡作為一種成像儀器，長期以來一直為精密制造和生命科學等領域的定性與定量分析和研究提供著有效而關鍵的支撐。2014年諾貝爾化學獎授予了美國科學家埃里克?貝齊格、威廉?莫納和德國科學家斯特凡?黑爾，以表彰他們?yōu)榘l(fā)展超分辨率熒光顯微鏡所作的貢獻。他們利用控制熒光分子特性的方式，克服了傳統(tǒng)光學顯微鏡分辨率受限于光學衍射極限的問題，實現(xiàn)了“熒光超分辨”成像。借助這種新興的生物醫(yī)學影像工具，研究人員可對生物體乃至細胞內部不同結構成分及其相互作用進行觀察分辨，這也使得動態(tài)記錄生命活體或者活細胞中的精細結構和動態(tài)變化成為可能。

迄今為止，基于光學硬件或者熒光探針的改進方案，都無法進一步使活細胞超分辨率熒光顯微成像提升到毫秒尺度60納米的時空分辨率。例如，非線性結構光顯微鏡（Structured Illumination Microscopy, SIM）雖可實現(xiàn)接近60納米的空間分辨率，但需以降低時間分辨率為代價，且需使用光漂白敏感的可光活化/光開關熒光蛋白。此外，由于細胞深層內部的分辨率和對比度仍然受到熒光發(fā)射和離焦平面散射的影響，高對比度超分辨率結構光顯微成像的成像深度只能被限制在0.1～1微米。因此，當前亟待找尋一種超分辨率方法，能夠在活細胞中實現(xiàn)約60納米空間分辨率的毫秒曝光或者進行多色、三維、長時間的超分辨率熒光顯微成像。

稀疏解卷積算法

應用與實踐

由稀疏解卷積算法與商用的轉盤共聚焦結構光顯微鏡（SD-SIM）結合得到的稀疏SD-SIM（Sparse SD-SIM），能夠以優(yōu)于90納米的分辨率實現(xiàn)多色、三維、長時間的活細胞超分辨率熒光顯微成像。合作團隊使用雙色稀疏SD-SIM在活細胞中觀測到了內質網(wǎng)與溶酶體接觸的事件。稀疏SD-SIM還可進行四色超分辨率成像，能夠在活細胞中同時觀測溶酶體、線粒體、微管和細胞核的動態(tài)圖像（見圖4）。類似地，合作團隊在活體COS-7細胞的軸線上觀察到細胞核、線粒體和微管的三維圖像，并進行了三色成像，如圖5（a）所示。經(jīng)過稀疏解卷積優(yōu)化后，微管成像點擴散函數(shù)（PSF）的軸向半高寬（FWHM）從465納米降低到228納米，如圖5（b）所示。此外可以觀察到，在一些軸向面被微管絲和線粒體侵入的區(qū)域，連續(xù)的、凸狀的核結構向內彎曲變成凹狀，如圖5（c）所示。這種相互作用的變化表明微管蛋白網(wǎng)絡可能會影響細胞核的組裝和形態(tài)。

合作團隊提出的稀疏解卷積算法是一種實現(xiàn)計算超分辨率熒光顯微成像的全新方法，而與基于特定物理原理或特殊熒光探針的超分辨率方法都不相同。通過實際的生物樣本實驗量化，稀疏解卷積算法被證明能夠實現(xiàn)接近2倍穩(wěn)定的空間分辨率提升，而不需要付出額外的硬件代價。稀疏解卷積算法與超快超分辨率結構光顯微鏡系統(tǒng)結合形成的稀疏SIM，更是目前活細胞光學成像中有著最高分辨率、最快速度、最長成像時間的超分辨率光學顯微成像手段，可用于觀察活細胞中囊泡分泌孔道和新中間態(tài)，辨識線粒體內嵴及其動態(tài)過程，記錄不同蛋白標記的核孔復合體與小窩蛋白環(huán)狀結構的動態(tài)過程。此外，稀疏解卷積算法具備較好的通用性，可與現(xiàn)有多數(shù)商業(yè)熒光顯微鏡進行結合應用，有效提升其空間分辨率，從而使其能夠觀察到更清楚的精細結構及動態(tài)。

未來，合作團隊將進一步開發(fā)相關軟件、數(shù)據(jù)庫和工程化硬件平臺，同時開展相關成果的產(chǎn)業(yè)化推廣工作，以期早日為神經(jīng)生物學、發(fā)育生物學、細胞生物學、遺傳生物學、移植生物學等研究及臨床應用提供更為高效的活體影像工具。