世界上沒(méi)有兩片完全相同的葉子，細(xì)胞也是。然而，科學(xué)家們?cè)谶M(jìn)行現(xiàn)代生物學(xué)研究時(shí)，大多時(shí)候都考察的是細(xì)胞群體，而忽略了細(xì)胞異質(zhì)性。

就拿神經(jīng)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，大腦中有億萬(wàn)個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，這些神經(jīng)細(xì)胞在細(xì)胞形態(tài)，突觸連結(jié)，細(xì)胞結(jié)構(gòu)，電生理以及生理功能上具有高度的多樣性。不同種類的神經(jīng)細(xì)胞中，其基因組、蛋白組、化學(xué)分子組成、含量、代謝也都有著很大的差別。在直徑不到1毫米的一個(gè)很小的腦區(qū)，可能就存在幾十種甚至上百種完全不同的神經(jīng)元以及膠質(zhì)細(xì)胞類型。甚至很多情況下，即使物理距離上相鄰的兩個(gè)神經(jīng)元也可能是兩個(gè)不同的神經(jīng)元類型。因此，對(duì)腦內(nèi)單個(gè)神經(jīng)元的基因組、蛋白質(zhì)組以及代謝組進(jìn)行分析，具有重要的生物學(xué)價(jià)值。

單細(xì)胞技術(shù)在近年發(fā)展非常迅速，比如單細(xì)胞測(cè)序，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種生命學(xué)科的研究。2014年1月Nature Methods上發(fā)表的年度特別報(bào)道，將“單細(xì)胞測(cè)序”(Singled out for sequencing)的應(yīng)用列為2013年度最重要的方法學(xué)進(jìn)展。

單細(xì)胞技術(shù)不僅在測(cè)序方面取得了極大進(jìn)展，單細(xì)胞質(zhì)譜分析也正在逐漸得到更多的關(guān)注。與用于分析單個(gè)細(xì)胞基因組的單細(xì)胞測(cè)序不同，單細(xì)胞質(zhì)譜主要是研究單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的代謝物情況，例如化學(xué)小分子的組成、含量和代謝等等。單細(xì)胞質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)在于可以高通量檢測(cè)目前其它單細(xì)胞技術(shù)無(wú)法檢測(cè)的小分子化合物，以及它們的代謝過(guò)程。同時(shí)，由于質(zhì)譜本身的優(yōu)勢(shì)，不需要采取測(cè)序或者特異性抗體等外部手段，就可以精確分析檢測(cè)到的化學(xué)物質(zhì)信息，可以說(shuō)是“物美價(jià)廉”。 不過(guò)，由于質(zhì)譜技術(shù)本身的局限性，目前還無(wú)法做到類似單細(xì)胞測(cè)序那樣的大規(guī)模測(cè)量。

多學(xué)科交叉合作，開發(fā)單神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)譜

2013年，熊偉教授結(jié)束了在美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院的博士后研究工作，回國(guó)后加入了中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。在申請(qǐng)中組部“青年千人計(jì)劃”時(shí)，熊偉教授認(rèn)識(shí)了另一位中科大化學(xué)學(xué)院的“青千”黃光明教授，當(dāng)時(shí)，黃光明教授課題組正在發(fā)展一種小樣品(pL級(jí)別)質(zhì)譜測(cè)量技術(shù)。經(jīng)過(guò)多次討論，他們決定將兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室的優(yōu)勢(shì)技術(shù)進(jìn)行結(jié)合，開發(fā)單神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)譜這一新技術(shù)。

目前質(zhì)譜技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用，主要還是采用對(duì)大量組織細(xì)胞勻漿后的樣品進(jìn)行分析。在單細(xì)胞檢測(cè)中，質(zhì)譜分析因?yàn)榫哂懈哽`敏度，大的線性范圍以及高通量分析化學(xué)分子的特點(diǎn)，逐漸被用于單細(xì)胞的細(xì)胞代謝分析。但目前的方法需要使用大量有機(jī)試劑對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，無(wú)法保持采樣時(shí)細(xì)胞的活性;冗長(zhǎng)的處理和分離過(guò)程也導(dǎo)致較慢的分析速度，無(wú)法短時(shí)間內(nèi)完成大量單細(xì)胞分析;并缺乏來(lái)自同一細(xì)胞的電生理信號(hào);最終導(dǎo)致單細(xì)胞代謝物的質(zhì)譜分析無(wú)法大規(guī)模用于神經(jīng)細(xì)胞的分析。

新技術(shù)讓質(zhì)譜分析活體單個(gè)神經(jīng)元成為現(xiàn)實(shí)

2017年1月26日，熊偉教授與黃光明教授等人在PNAS上發(fā)表了一項(xiàng)題為“Single-neuron identification of chemical constituents, physiological changes, and metabolism using mass spectrometry”的研究。在這項(xiàng)新研究中，研究團(tuán)隊(duì)依托電生理膜片鉗以及電噴霧離子源技術(shù)建立了一種穩(wěn)定的單神經(jīng)元胞內(nèi)組分取樣和質(zhì)譜組分分析技術(shù)。

膜片鉗與單細(xì)胞質(zhì)譜分析聯(lián)用技術(shù)分析單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞示意圖

電生理膜片鉗能將玻璃微電極接觸并吸附在細(xì)胞膜上，高阻抗封接后將膜打穿成孔，記錄膜片以外部位的全細(xì)胞膜的離子電流。而電噴霧技術(shù)主要是利用一個(gè)高壓交流電使分析物被離子化然后被質(zhì)譜檢測(cè)，該離子源具有較強(qiáng)的抗干擾能力。與傳統(tǒng)的質(zhì)譜方法相比，這一新方法最大的優(yōu)勢(shì)是可以原位對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行取樣，并且同時(shí)采集細(xì)胞位置、電生理活動(dòng)以及細(xì)胞內(nèi)化學(xué)成分等多方面的信息。

質(zhì)譜分析讓神經(jīng)化學(xué)研究進(jìn)入單細(xì)胞水平

研究人員利用這一方法對(duì)小鼠海馬、前額葉、杏仁核、紋狀體等腦區(qū)單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)的數(shù)千種化學(xué)小分子進(jìn)行了快速質(zhì)譜檢測(cè)，并同步采集了電生理信號(hào)。

海馬、前額葉、杏仁核、紋狀體這四個(gè)核團(tuán)無(wú)論是在人類還是低等動(dòng)物中都非常重要，與學(xué)習(xí)、記憶和情緒等行為以及相關(guān)疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等有著密切的聯(lián)系。這些核團(tuán)內(nèi)的神經(jīng)元種類繁多，目前國(guó)內(nèi)外有多個(gè)課題組正在從單細(xì)胞測(cè)序的角度解析這些核團(tuán)的神經(jīng)元分類及對(duì)其功能進(jìn)行鑒定。熊偉教授表示，他們對(duì)這四個(gè)核團(tuán)神經(jīng)元進(jìn)行質(zhì)譜研究，也正是想從單細(xì)胞水平全面分析這些核團(tuán)神經(jīng)元的代謝組學(xué)情況，以及這些代謝通路和代謝組在學(xué)習(xí)、記憶和情緒等行為及其相關(guān)疾病中的作用機(jī)制。

在這項(xiàng)研究中，研究人員主要對(duì)不同年齡段的小鼠海馬、杏仁核、紋狀體等腦區(qū)單個(gè)神經(jīng)元中的谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)以及GABA等化學(xué)小分子進(jìn)行定性、定量分析并對(duì)其進(jìn)行神經(jīng)元分類。

Glu和GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)兩大類神經(jīng)遞質(zhì)(興奮性或抑制性)的代表性分子。早期人們認(rèn)為一個(gè)神經(jīng)元內(nèi)只存在一種遞質(zhì)，其全部末梢只能釋放同一種遞質(zhì)，這被稱之為戴爾原則(Dale's principle)。然而隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識(shí)到兩種或兩種以上遞質(zhì)(包括調(diào)質(zhì))可存在于同一神經(jīng)元內(nèi)，在適當(dāng)?shù)拇碳は驴山?jīng)突觸前膜共同釋放。這種新的觀點(diǎn)得到了眾多電生理及免疫組化等實(shí)驗(yàn)的證明。然而這些證據(jù)大部分都是間接的證據(jù)，尚無(wú)直接證據(jù)表明二者的共存。這項(xiàng)研究首次在單細(xì)胞水平，通過(guò)質(zhì)譜分析給出了二者共存于同一神經(jīng)元內(nèi)的直接證據(jù)。同時(shí)，研究人員還發(fā)現(xiàn)了一些尚未在神經(jīng)系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)的小分子，他們正在努力研究其作用和分子機(jī)制。

此外，研究還鑒定了單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)谷氨酰胺的代謝路徑。Gln-Glu-GABA通路是谷氨酸和GABA代謝的經(jīng)典通路，尤其是谷氨酸，它不僅僅作為興奮性神經(jīng)遞質(zhì)存在于神經(jīng)元內(nèi)，還大量參與到蛋白質(zhì)的合成代謝以及細(xì)胞能量供應(yīng)體系中。而GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性遞質(zhì)，可以防止神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度興奮。二者與各種腦疾病都有著密切的關(guān)系，如自閉癥、阿爾茨海默病、帕金森病等。該通路在大腦的發(fā)育和衰老中扮演著非常重要的角色。對(duì)單個(gè)神經(jīng)元內(nèi)谷氨酰胺的代謝路徑的鑒定對(duì)于深入理解這條代謝通路以及與之相關(guān)的疾病機(jī)制具有重要意義。

這項(xiàng)研究首次利用化學(xué)質(zhì)譜方法直接無(wú)稀釋地檢測(cè)單個(gè)神經(jīng)元中多種神經(jīng)遞質(zhì)、代謝物、脂質(zhì)等化學(xué)小分子，對(duì)單個(gè)神經(jīng)元化學(xué)成分及代謝物進(jìn)行了即時(shí)分析，并將目前神經(jīng)細(xì)胞成分分析的研究推向了一個(gè)活細(xì)胞及單細(xì)胞水平。這一技術(shù)在將來(lái)或許能夠幫助科學(xué)家們?cè)趩渭?xì)胞層次上去研究神經(jīng)生物學(xué)、代謝組學(xué)、毒理學(xué)等生命科學(xué)的重大問(wèn)題。

談到臨床應(yīng)用前景時(shí)，熊偉教授的態(tài)度也十分肯定。他表示，該技術(shù)允許研究人員對(duì)血液、腦脊液等樣品中的單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，結(jié)合相應(yīng)的生物標(biāo)記物，完全有可能對(duì)阿爾茨海默病、帕金森病、抑郁癥等神經(jīng)精神疾病的早期診斷提供幫助。