X射線晶體衍射技術(shù)(X-RAY CRYSTALLOGRAPHY)即將成為歷史，低溫電子顯微技術(shù)(CRYO-ELECTRON MICROSCOPY)引起了揭示細(xì)胞內(nèi)隱秘機(jī)制的革命。

在劍橋大學(xué)一幢建筑的地下室里，一場技術(shù)革命正在醞釀。

一個笨重的、大約3米高的金屬盒子通過連接細(xì)胞的橙色纜線，安安靜靜地傳輸著以萬億字節(jié)計(jì)算的數(shù)據(jù)。這是世界上最先進(jìn)的低溫電子顯微鏡之一：低溫電子顯微鏡通過電子束對冷凍的生物分子進(jìn)行成像，從而得到分子的三維結(jié)構(gòu)。站在這個耗資770萬美金的儀器旁，英國醫(yī)學(xué)研究委員會分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室(UK Medical Research Council Laboratory of Molecular Biology， LMB)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家 Sjors Scheres表示，低溫電子顯微鏡非常敏感，一聲喊叫就會帶來極大誤差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。“英國需要更多低溫電子顯微鏡，因?yàn)槲磥硭鼤蔀榻Y(jié)構(gòu)生物學(xué)的主流。”

低溫電子顯微鏡震驚了結(jié)構(gòu)生物學(xué)。過去30年里，低溫電子顯微鏡揭示了核糖體、膜蛋白和其它關(guān)鍵細(xì)胞蛋白的精細(xì)結(jié)構(gòu)。這些發(fā)現(xiàn)都發(fā)表在頂級雜志上。結(jié)構(gòu)生物學(xué)家們表示，毫不夸張地說，低溫電子顯微技術(shù)正處于革命之中：低溫電子顯微鏡能夠快速生成高分辨率的分子模型，這一點(diǎn)遠(yuǎn)超X射線晶體衍射等方法。依靠舊方法獲得諾獎的實(shí)驗(yàn)室也在努力學(xué)習(xí)這一技術(shù)。這種新模型能夠準(zhǔn)確地揭示細(xì)胞運(yùn)行的必要機(jī)制，以及如何靶向針對疾病相關(guān)的蛋白。

“低溫電子顯微鏡能夠解決很多以前無法解決的謎題。”舊金山加利福利亞大學(xué)(University of California)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家David Agard這樣說道。

幾年前Scheres被招進(jìn)LMB，任務(wù)是幫助改進(jìn)低溫電子顯微鏡，最終他成功了。上個月，他們發(fā)表了這個領(lǐng)域最令人振奮的成就：阿茲海默癥相關(guān)的酶的高清圖片，圖片包括該酶的1200左右個氨基酸，分辨率達(dá)到零點(diǎn)幾納米。

生物學(xué)家們?nèi)缃袢栽谂Πl(fā)展該技術(shù)，以期用它解決小分子或可變形分子的精微結(jié)構(gòu)——這對低溫電子顯微鏡來說，也是一大挑戰(zhàn)。來自加利福利亞大學(xué)(University of California)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Eva Nogales表示，叫它革命也好，飛躍也好，低溫電子顯微鏡的確打開了一扇大門。

蛋白結(jié)晶

結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域有一條不成文的觀點(diǎn)：結(jié)構(gòu)決定功能。只有知道生物分子的原子排布，研究者們才能了解這個蛋白的功能。例如，核糖體是如何根據(jù)mRNA的序列來制造蛋白，分子孔道是如何開和關(guān)的。幾十年來，分析蛋白結(jié)構(gòu)有一個無冕之王——X射線晶體衍射。在X射線晶體衍射中，科學(xué)家們讓蛋白結(jié)晶，接著利用X射線照射，隨后根據(jù)X射線的衍射來重建蛋白的結(jié)構(gòu)。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)銀行(Protein Data Bank)的100，000多條蛋白詞目里，超過90%的蛋白結(jié)構(gòu)是利用X射線晶體衍射技術(shù)解析得到的。很多諾貝爾獎也與這一技術(shù)相關(guān)，例如1962年揭示DNA雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)的諾獎。

盡管X射線晶體衍射一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)家的最佳工具，但是它有較大的限制。科學(xué)家們可能需要幾年才能找到把蛋白形成大塊結(jié)晶的方法。而很多基礎(chǔ)蛋白分子，例如嵌在細(xì)胞膜上的蛋白，或是形成復(fù)合體的蛋白卻無法被結(jié)晶。

當(dāng)Richard Henderson 1973年到LMB，研究菌視紫紅質(zhì)(一種利用光把質(zhì)子運(yùn)進(jìn)膜內(nèi)的蛋白)結(jié)構(gòu)時(shí)，X射線晶體衍射是首選工具。Henderson和他的同事Nigel Unwin成功地做出了該蛋白的二維結(jié)晶，但卻不適用于X射線衍射。因此他們決定使用電子顯微鏡。

當(dāng)時(shí)，電子顯微鏡主要用于研究用重金屬染過色的病毒或組織切片。一束光子打在樣本上，新生的電子被檢測到，被用于解析樣本結(jié)構(gòu)。這種方法成功制作了第一幅病毒的精微圖片——一種煙草病毒。但染色導(dǎo)致無法看清各個蛋白，更不要說原子細(xì)節(jié)了。Agarad表示，樣本上要么滿是斑點(diǎn)，要么沒染上，你只能看到分子的輪廓。

Herderson等人省略了染色的步驟，把菌視紫紅質(zhì)的單層晶體放到金屬網(wǎng)格中，然后用電子顯微鏡進(jìn)行成像。Agard表示，這個過程里，你看到的是蛋白的原子。這在當(dāng)時(shí)是很大的進(jìn)步，因?yàn)楫?dāng)時(shí)人們都認(rèn)為不可能利用電子顯微鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)。Henderson等人在1975年發(fā)表了這一成果。

20世紀(jì)80年代和90年代，低溫電子顯微鏡領(lǐng)域發(fā)展迅速。一個關(guān)鍵性突破是利用液態(tài)乙烷來快速冷凍蛋白溶液。這也是為什么叫低溫電子顯微鏡的原因。但這個技術(shù)的分辨率僅為1納米，遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到針對蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行藥物設(shè)計(jì)的需求。而當(dāng)時(shí)X射線晶體衍射的分辨率能達(dá)到0.4納米。NIH等資助者投入了數(shù)億美金來支持蛋白晶體領(lǐng)域的發(fā)展，但對于低溫電子顯微鏡領(lǐng)域的資助卻很少。

1997年，Henderson參加了高登研究會議(Gordon Research Conference )關(guān)于3D電子顯微鏡的年會。一位同事以這樣的話做為開幕致詞，“低溫電子顯微鏡技術(shù)非常有限，不可能超越X射線晶體衍射。” 但Henderson的想法完全不同，在下一場發(fā)言中，他做出了反擊。Henderson指出，低溫電子顯微鏡會超越其它各種技術(shù)，成為全球研究蛋白結(jié)構(gòu)的主流工具。

革命由此開始

在此之后，Henderson等人致力于提高電子顯微鏡的性能——尤其是感知電子的靈敏度。在數(shù)碼相機(jī)席卷全球很多年后，很多電子顯微鏡學(xué)家仍然傾向于使用傳統(tǒng)的膠片，因?yàn)楸绕饠?shù)碼感應(yīng)器，膠片能更有效地記錄電子。與顯微鏡生產(chǎn)商合作時(shí)，研究者們發(fā)明了一種新的直接電子探測器，這種探測器的靈敏度遠(yuǎn)高于膠片和數(shù)碼相機(jī)探測器。

大約在2012年，這種探測器能夠以一分鐘幾十幀的高速得到單個分子原子的連續(xù)圖像。同時(shí)，和Scheres一樣的研究者們精心編寫了將多張2D圖片建成3D模型的軟件程序。這些3D圖像的畫質(zhì)可以媲美X射線晶體衍射獲得的圖像。

低溫電子顯微鏡適用于研究大的、穩(wěn)定的分子，這些分子能夠承受電子的轟擊，而不發(fā)生變形——由多個蛋白組成的分子機(jī)器是最好的樣本。因此由RNA緊緊圍繞的核糖體是最佳的樣本。三位化學(xué)家用X射線晶體衍射研究核糖體溶液的工作在2009年獲得了諾貝爾化學(xué)獎，但這些工作花了幾十年。近幾年，低溫電鏡研究者們也陷入了“核糖體熱”。多個團(tuán)隊(duì)研究了多種生物的核糖體，包括人類核糖體的首個高清模型。X射線晶體衍射的研究成果遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于LMB的Venki Ramakrishnan實(shí)驗(yàn)室，Venki獲得了2009年的諾獎。Venki表示，對于大分子來說，低溫電子顯微鏡遠(yuǎn)比X射線晶體衍射要實(shí)用。

這幾年，低溫電子顯微鏡的相關(guān)文章有很多：2015年一年，這個技術(shù)就用于100多個分子的結(jié)構(gòu)研究。X-射線晶體衍射只能對單個、靜態(tài)的蛋白晶體成像，但低溫電子顯微鏡能夠?qū)Φ鞍椎亩喾N構(gòu)象進(jìn)行成像，幫助科學(xué)家們推斷蛋白的功能。

5月，多倫多大學(xué)(University of Toronto)結(jié)構(gòu)生物學(xué)家John Rubinstein等人使用了100，000張低溫電子顯微鏡圖片來生成V-ATPase 的“分子電影”，V-ATPase的作用是消耗ATP，把質(zhì)子運(yùn)進(jìn)運(yùn)出細(xì)胞液泡。”我們發(fā)現(xiàn)，這個酶非常靈活，可以彎折、扭曲和變型。” Rubinstein說道。他認(rèn)為，這是由于這個酶的靈活性，它能夠高效地把ATP 釋放的能量傳遞到質(zhì)子泵。

2013年Nogales的團(tuán)隊(duì)拼接了調(diào)控DNA轉(zhuǎn)錄成RNA的復(fù)合體的結(jié)構(gòu)。他們發(fā)現(xiàn)，復(fù)合體的一個臂上懸掛著緊繞DNA鏈的10納米結(jié)構(gòu)，這段結(jié)構(gòu)可能影響基因轉(zhuǎn)錄。Nogales表示，這個結(jié)構(gòu)很漂亮，它可以幫助我們分析這個分子起作用的機(jī)制。

小而漂亮

現(xiàn)在低溫電鏡迅猛發(fā)展，專家們正在尋找更大的挑戰(zhàn)作為下一個解析目標(biāo)。對很多人來說，最想解析的是夾在細(xì)胞膜內(nèi)的蛋白。這些蛋白是細(xì)胞信號通路中的關(guān)鍵分子，也是比較熱門的藥物靶標(biāo)。這些蛋白很難結(jié)晶，而低溫電子顯微鏡不大可能對單個蛋白進(jìn)行成像，這是因?yàn)楹茈y從背景噪音中提取這些信號。

這些困難都無法阻擋加利福利亞大學(xué)(University of California)的生物物理學(xué)家程亦凡。他計(jì)劃解析一種細(xì)小的膜蛋白TRPV1。TRPV1是檢測辣椒中引起灼燒感的物質(zhì)的受體，并與其它痛感蛋白緊密相關(guān)。加利福利亞大學(xué)病理學(xué)家David Julius等人之前嘗試結(jié)晶TRPV1，結(jié)果失敗。用低溫電子顯微鏡解析TRPV1項(xiàng)目，一開始進(jìn)展緩慢。但2013年底，技術(shù)進(jìn)步使得這一項(xiàng)目有了重大突破，他們獲得了分辨率為0.34納米的TRPV1蛋白的結(jié)構(gòu)。該成果的發(fā)表對于領(lǐng)域來說，無異于驚雷。因?yàn)檫@證實(shí)了低溫電子顯微鏡能夠解析小的、重要的分子。“當(dāng)我看到TRPV1的結(jié)構(gòu)時(shí)，我激動得一晚上睡不著覺。”Rubinstein說道。

研究者們可能面臨更多這樣無眠的夜晚。Agard表示，會有更多膜蛋白相繼被解析出來。

上個月由Scheres和清華大學(xué)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家施一公合作發(fā)表的一篇文章就成功解析了一個膜蛋白。他們建立了γ-分泌酶的模型，γ-分泌酶負(fù)責(zé)合成與阿茲海默癥相關(guān)的β-淀粉斑。0.34納米分辨率的圖譜顯示，比較少見的遺傳性阿爾茨海默病的γ-分泌酶突變后會在圖譜上呈現(xiàn)兩個“熱點(diǎn)”(突變或者重組頻率顯著增加的位點(diǎn))，并且這種突變最終會合成有毒性的β-淀粉斑。γ-分泌酶的結(jié)構(gòu)圖幫助研究者發(fā)現(xiàn)為什么以往的抑制劑會無效，從而促進(jìn)新藥的研發(fā)。程亦凡表示，γ-分泌酶的結(jié)構(gòu)非常驚人。

類似的成功吸引了制藥公司的注意。他們希望借助低溫電子顯微鏡去解析那些無法結(jié)晶的蛋白，從而更好地研發(fā)藥物。Scheres如今和輝瑞公司合作，攻克離子通道。離子通道包含很多膜蛋白，例如痛感受分子和神經(jīng)遞質(zhì)受體。“我?guī)缀醣幻恳粋€人聯(lián)系過。”Nogales這樣說道。

盡管低溫電子顯微鏡發(fā)展迅速，很多研究者認(rèn)為，它仍有巨大提升空間。他們希望能制造出更靈敏的電子探測器，以及更好地制備蛋白樣本的方法。這樣的話，就能夠?qū)Ω〉摹⒏鼊討B(tài)的分子進(jìn)行成像，并且分辨率更高。5月，有研究者發(fā)表了一篇細(xì)菌蛋白的結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到了0.22納米。這也顯示了低溫顯微鏡的潛力。

與任何熱門領(lǐng)域一樣，低溫電子顯微鏡的發(fā)展也有煩惱。一些專家擔(dān)心研究者們盲目追求該儀器會誘發(fā)一些問題。2013年HIV表面蛋白的結(jié)構(gòu)圖遭到了科學(xué)家們的質(zhì)疑，他們認(rèn)為用于建模的圖片很多都是白噪聲。此后，其他團(tuán)隊(duì)得到的X射線晶體衍射和低溫電子顯微鏡模型也對原模型提出了質(zhì)疑。但這些研究者們堅(jiān)持相信自己的結(jié)果。今年6月，在高登研究會議(Gordon Research Conference )上，研究者們希望低溫電子顯微鏡的結(jié)構(gòu)圖要有嚴(yán)格的質(zhì)量控制。并且雜志要求作者們提供詳細(xì)的建模方法。

成本問題可能會限制低溫電子顯微鏡的推廣。Scheres估計(jì)，LMB每天用于支持低溫電子顯微鏡的經(jīng)費(fèi)就達(dá)到近3萬人民幣，外加近1萬的電費(fèi)——這是由于存儲和處理圖片的電腦耗電量很大。Scheres表示，每天至少要花費(fèi)近4萬人民幣，對于很多地方來說，這個費(fèi)用太高。為了推廣低溫電子顯微鏡，很多基金會建立了對外公開的設(shè)備，各地研究者們可以預(yù)約使用?；羧A德·休斯醫(yī)學(xué)研究所(Howard Hughes Medical Institute， HHMI)在珍利亞農(nóng)場研究園區(qū)配備了一臺。這臺設(shè)備對所有HHMI資金的研究者公開。在英國，政府和維康信托在牛津大學(xué)附近建立了低溫電鏡公開使用平臺。參與該平臺搭建的倫敦大學(xué)(University of London)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)家Helen Saibil表示，有很多人想學(xué)習(xí)使用低溫電鏡。

洛克菲勒大學(xué)(Rockefeller University)的生物物理學(xué)家Rod MacKinnon就是這些人之一。他在2003年因解析一些離子通道的結(jié)晶結(jié)構(gòu)而獲得諾貝爾獎。MacKinnon現(xiàn)在對低溫電鏡非常著迷。“我現(xiàn)在處于學(xué)習(xí)曲線的斜坡階段，非常熱切。” MacKinnon這樣說道。他打算用低溫電鏡來研究離子通道是如何開和關(guān)的。

1997年時(shí)，Henderson非常堅(jiān)定地宣稱，低溫電鏡會成為解析蛋白結(jié)構(gòu)的主流工具。在將近20年后的今天，他的預(yù)測比當(dāng)年有了更多底氣。 Henderson表示，如果低溫電鏡保持這樣的勢頭繼續(xù)發(fā)展，技術(shù)問題也得以解決，那么低溫電鏡不僅會成為解析蛋白結(jié)構(gòu)的第一選擇，而是主流選擇。這個目標(biāo)已經(jīng)離我們不遠(yuǎn)了。