摘　要　

為滿足臨床醫(yī)學(xué)基因診斷的需要，本研究以場效應(yīng)管為基體傳感器，并在柵區(qū)構(gòu)建單鏈核苷酸敏感柵，實(shí)現(xiàn)對目的基因快速、定點(diǎn)、在體檢測。本文介紹了DNA場效應(yīng)管傳感器的敏感機(jī)理和定量依據(jù)，并就傳感器結(jié)構(gòu)、自組裝單分子膜技術(shù)、雜交指示劑、多道測量技術(shù)等進(jìn)行設(shè)計(jì)和探討。

分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，給臨床醫(yī)學(xué)診斷以巨大的影響，與疾病相關(guān)的DNA片段的檢測即“基因診斷”成為一種新興的臨床診斷方法，加之本世紀(jì)內(nèi)能與阿波羅登月計(jì)劃媲美的人類基因組計(jì)劃的完成和其它相關(guān)技術(shù)的發(fā)展，使基因診斷技術(shù)不斷提高，日臻成熟。

目前，基因診斷均采用PCR技術(shù)，它以其簡便、快速、靈敏的優(yōu)勢，成為臨床診斷的技術(shù)熱點(diǎn)，但是PCR技術(shù)存在急需解決的二大問題：一是不能定量，二是污染所致的假陽問題。

近年來，生物傳感器飛速發(fā)展，人們把生物技術(shù)與現(xiàn)代物理、化學(xué)、微電子學(xué)技術(shù)結(jié)合起來，研制了各種各樣的生物傳感器，從酶傳感器發(fā)展到抗原(抗體)傳感器，乃至基因(DNA)傳感器[1]。DNA傳感器的出現(xiàn)使對目的DNA的測量時(shí)間大大縮短，操作簡便，無污染，既可定性，又可定量。且靈敏度高、選擇性好，顯示出誘人的發(fā)展前景。

本研究以場效應(yīng)管傳感器為基體傳感器，通過設(shè)計(jì)場效應(yīng)管柵區(qū)自組裝單分子膜技術(shù)，設(shè)計(jì)雜交指示劑，建立DNA場效應(yīng)管傳感器制備方法，為臨床醫(yī)學(xué)基因診斷技術(shù)提供新方法、新器材。

1　結(jié)構(gòu)與組成

DNA場效應(yīng)管傳感器由敏感元件、加熱元件、測溫元件等集成而成。

圖1　DNA傳感器內(nèi)部結(jié)構(gòu)圖

敏感元件有漏極(D)、源極(S)和柵極(G，生物敏感柵)組成，測溫元件為測溫二極管。DNA傳感器內(nèi)部結(jié)構(gòu)見圖1。

2　工作原理

DNA場效應(yīng)管傳感器對靶DNA的選擇測定，即定性機(jī)理是基于分子雜交技術(shù)，DNA傳感器工作原理見圖2。

在場效應(yīng)管的柵區(qū)，固定一條含有十幾到上千個(gè)核苷酸單鏈DNA(ssDNA)，通過分子雜交，達(dá)到對另一條含有互補(bǔ)堿基序列DNA的識別，形成雙鏈DNA(dsDNA)，待測分子含量通過換能器表達(dá)出來。定量原理如下：

圖2　DNA傳感器工作原理

場效應(yīng)管在飽和區(qū)的閾電壓為：

VT=VD-2ID/β1/2

當(dāng)待測物分子與敏感柵作用時(shí)，發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致功函數(shù)變化，使閾電壓偏移，其改變量ΔVT，可用IT保持恒定時(shí)的漏電壓表示出來。

DNA場效應(yīng)管傳感器把生物敏感柵的敏感特性和場效應(yīng)管的場致響應(yīng)結(jié)合起來，其作用機(jī)理是分子生物學(xué)，結(jié)構(gòu)形式是膜，表現(xiàn)的現(xiàn)象是電。

3　基體傳感器的設(shè)計(jì)及敏感柵的制備

基體傳感器的設(shè)計(jì)：

選用P型硅材料，芯片面積2×2mm2，溝道長度為30μm，采用半導(dǎo)體集成工藝制備，DNA版圖示意見圖3。

圖3　DNA傳感器版圖示意圖

敏感柵的制備：

敏感柵采用自組裝單分子膜技術(shù)，包括表面處理、表面化學(xué)修飾、自組裝工藝等三個(gè)環(huán)節(jié)，其實(shí)質(zhì)是連續(xù)手臂的選擇和DNA與手臂的連接[2]。

4　雜交指示劑的設(shè)計(jì)

為了提高檢測靈敏度，必須研制、應(yīng)用雜交指示劑[3，4]。雜交指示劑是一類能與ssDNA和dsDNA以不同方式相互結(jié)合的物質(zhì)，雜交指示劑與DNA分子的結(jié)合有三種基本模式：(1)雜交指示劑與DNA分子雙螺旋的堿基對之間的大溝槽相互作用，產(chǎn)生嵌入作用;(2)雜交指示劑與DNA分子雙螺旋的堿基對之間的小溝槽相互作用而結(jié)合，產(chǎn)生耦合作用;(3)雜交指示劑與DNA分子的帶負(fù)電荷的核酸—磷酸基骨架之間的靜電相互作用。無論哪一種結(jié)合都會使DNA分子變成“夾心面包”導(dǎo)致幾何狀態(tài)的畸變，基于雜交指示劑與ssDNA和dsDNA選擇性結(jié)合能力的差異，雜交指示劑的選用將大大提高傳感器的靈敏度。

分子設(shè)計(jì)新型雜交指示劑，一方面要設(shè)計(jì)雙嵌合劑、三嵌合劑以便產(chǎn)生“分子剪刀”功能，另一方面要增加離域化π電子共軛鍵，有利于在外電場作用下電子在鍵中的傳遞。

5　信號測量系統(tǒng)的設(shè)計(jì)

為了自動測量DNA傳感器輸出特性，設(shè)計(jì)以微型計(jì)算機(jī)為主體的測量系統(tǒng)，該系統(tǒng)由一臺IBM-AT微機(jī)、DT2801型A/D及D/A輸入/輸出接口板和電壓/電流轉(zhuǎn)換器組成[5]。DNA特性曲線自動測量方框圖見圖4。

本系統(tǒng)具有菜單、復(fù)位、置位、查錯(cuò)、測試、顯示及打印特性曲線等功能，并建立多道測量技術(shù)，以提高檢測的可靠性。

圖4　DNA傳感器特性曲線自動測量系統(tǒng)方框圖

6　結(jié)　語

DNA場效應(yīng)管傳感器探測的是DNA分子之間的相互作用，靈敏度高、響應(yīng)快，其靈敏度可達(dá)ng級，甚至pg級。由于該傳感器采用半導(dǎo)體集成技術(shù)制備，可實(shí)現(xiàn)陣列化，并可實(shí)現(xiàn)多基因的同步檢測。據(jù)此，加強(qiáng)DNA場效應(yīng)管傳感器的穩(wěn)定性和可靠性研究，可望在“基因診斷”中占有一席之地。

7　參考文獻(xiàn)

[1]　Tsuruta H,et al.Detection of the products of polymerase chain reaction by an ELISA system based on an ion sensitive field effect transistor.J Immunol Method,1994,176(1):45

[2] Wood S J.DNA-DNA hybridization in real time using BIAcore.Microchem J,1993,47:330

[3] 龐代文，等。DNA的電化學(xué)研究?；瘜W(xué)通報(bào)，1994，2：1

[4]　Hashimoto K,et al.Novel DNA sensor for electrochemical gene detection.Anal Chim Acta,1994,286:219

[5]　聶邦畿。微機(jī)在ISFET特性測量中的應(yīng)用?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)儀器與應(yīng)用，1997，4：2