PCR實(shí)驗(yàn)室是分子診斷的基礎(chǔ)，也是進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)的必備場(chǎng)所。近些年，分子診斷行業(yè)快速發(fā)展，使得很多IVD從業(yè)者對(duì)PCR的認(rèn)識(shí)又進(jìn)入到了一個(gè)新的階段，但是基于實(shí)驗(yàn)室的基本知識(shí)仍然是非常重要的一環(huán)。

PCR實(shí)驗(yàn)室的設(shè)計(jì)原則

原則上應(yīng)當(dāng)設(shè)置4個(gè)區(qū)域：試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

根據(jù)使用儀器的功能，區(qū)域可適當(dāng)合并。使用實(shí)時(shí)熒光PCR儀，擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并;

采用樣本處理、核酸提取及擴(kuò)增檢測(cè)為一體的自動(dòng)化分析儀，則標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可合并。

各區(qū)功能必備物品清單：01

試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)(1區(qū))

功能：

貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。

必備物品：

2～8℃和-20℃以下冰箱。

混勻器。

微量加樣器(覆蓋0.2-1000μl)

02

標(biāo)本制備區(qū)(2區(qū))

功能：

核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對(duì)于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個(gè)人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。

必備物品：

2-8℃冰箱、-20℃或-80℃冰箱。

高速離心機(jī)。

混勻器。

水浴箱或加熱模塊。

微量加樣器(覆蓋0.2-1000μl)。

生物安全柜。

03

擴(kuò)增區(qū)(3區(qū))

功能：

cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測(cè)。

必備物品：

核酸擴(kuò)增儀(或熒光定量PCR儀)

04

擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)(4區(qū))

功能：

擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測(cè)定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測(cè)序等。

必備物品：

雜交儀、電泳儀、測(cè)序儀等

微量加樣器(覆蓋0.2-1000μl)

通用物品(4個(gè)區(qū)都有可能需要)

可移動(dòng)紫外燈(近工作臺(tái)面)。

消耗品：一次性手套、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭。

專用工作服和工作鞋(套)。

專用辦公用品。

樣本管架(2區(qū))

防爆夾(2區(qū))

PCR管架(2區(qū)、傳遞窗)

其他物品

PCR實(shí)驗(yàn)室工作基本原則

1.進(jìn)入各工作區(qū)域應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行

試劑儲(chǔ)存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→ 擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)。

2.各工作區(qū)域必須有明確的標(biāo)記，不同工作區(qū)域內(nèi)的設(shè)備、物品不得混用。

3.不同的工作區(qū)域使用不同的工作服(例如不同的顏色)。工作人員離開各工作區(qū)域時(shí)，不得將工作服帶出。

4.實(shí)驗(yàn)室的清潔應(yīng)當(dāng)按試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)→標(biāo)本制備區(qū)→擴(kuò)增區(qū)→擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)的方向進(jìn)行。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)當(dāng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。

5.工作結(jié)束后，必須立即對(duì)工作區(qū)進(jìn)行清潔。工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面應(yīng)當(dāng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的紫外照射應(yīng)當(dāng)方便有效。

由于紫外照射的距離和能量對(duì)去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動(dòng)紫外燈(254nm波長(zhǎng))，在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺(tái)上60～90cm內(nèi)照射。當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物僅幾百或幾十堿基對(duì)(bp)，對(duì)紫外線損傷不敏感。

6.實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》(GB19489-2008)。

熒光PCR檢測(cè)試劑盒是一種用于在PCR反應(yīng)中檢測(cè)特定DNA序列的試劑盒。這種試劑盒包括引物、熒光探針和緩沖液，它們的作用相互協(xié)同，實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。

熒光PCR檢測(cè)試劑盒使用步驟:

1.提取目標(biāo)DNA:從待檢測(cè)的樣品(如血、組織等)中提取目標(biāo)DNA,并加入PCR反應(yīng)管中。

2. PCR反應(yīng)體系準(zhǔn)備:將PCR反應(yīng)體系中所需要的檢測(cè)試劑盒配制好，根據(jù)試劑盒說明書加入引物、熒光探針及緩沖液等試劑，并混合均勻。

3.反應(yīng)條件設(shè)定:根據(jù)待擴(kuò)增的DNA片段大小和設(shè)計(jì)的引物溫度，設(shè)定PCR反應(yīng)的溫度程序和時(shí)間。

4. PCR反應(yīng)進(jìn)行:將PCR反應(yīng)管放入PCR儀中，進(jìn)行PCR反應(yīng)。在PCR反應(yīng)過程中， 引物將特異性地結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上，然后通過PCR循環(huán)反應(yīng)不斷擴(kuò)增目標(biāo)DNA。

5.熒光信號(hào)檢測(cè):隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，熒光探針與目標(biāo)DNA序列雜交，產(chǎn)生熒光信號(hào)。熒光信號(hào)大小與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物數(shù)量成正比，可通過熒光定量PCR分析儀檢測(cè)熒光信號(hào)大小，從而間

接獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的數(shù)量。

6.結(jié)果分析:根據(jù)樣品是否出現(xiàn)熒光信號(hào)來判斷目標(biāo)DNA序列是否存在。如果出現(xiàn)熒光信號(hào)，則說明樣品中存在目標(biāo)DNA序列，反之則說明不存在。

熒光PCR檢測(cè)試劑盒存儲(chǔ)及使用注意事項(xiàng)：

1.儲(chǔ)存溫度:檢測(cè)試劑盒應(yīng)儲(chǔ)存在干燥、陰涼、避光處，通常在-20°C以下保存。

2.攪拌均勻:使用前應(yīng)將試劑盒中的各種試劑攪拌均勻，以避免試劑沉淀或結(jié)晶。

3.避免凍融:避免多次凍融使用，以免影響試劑盒的靈敏度和穩(wěn)定性。

4.嚴(yán)格按說明書操作:使用檢測(cè)試劑盒時(shí)，一定要嚴(yán)格按照說明書 上的步驟進(jìn)行操作，避免操作失誤導(dǎo)致結(jié)果偏差。

據(jù)國(guó)家衛(wèi)健委官網(wǎng)數(shù)據(jù)顯示11月15日0—24時(shí)，31個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)報(bào)告新增確診病例1623例，截至11月15日24時(shí)，據(jù)31個(gè)省(自治區(qū)、直轄市)和新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)報(bào)告，現(xiàn)有確診病例15345例(其中重癥病例29例)，我國(guó)疫情防控形勢(shì)依然嚴(yán)峻。

檢驗(yàn)人員是核酸檢測(cè)工作的主力軍，他們不但要保證檢測(cè)結(jié)果的有效性，還時(shí)刻面臨著被感染的風(fēng)險(xiǎn)。

本文為大家講解《PCR實(shí)驗(yàn)室新冠核酸檢測(cè)操作注意事項(xiàng)》，重點(diǎn)從新冠病毒生理特性、熒光PCR原理、PCR實(shí)驗(yàn)室籌備規(guī)范、樣本檢測(cè)環(huán)節(jié)操作、實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)分析、常見問題解析等幾個(gè)方面討論學(xué)習(xí)。

PCR實(shí)驗(yàn)原理

重復(fù)進(jìn)行“變性 - 退火 - 延伸” 三個(gè)過程，模板DNA的量就會(huì)呈指數(shù)倍增加，理論上講經(jīng)過 n 個(gè)循環(huán)之后，模板量就會(huì)達(dá)到2的n次方。

常見問題解析

1、新冠試劑出現(xiàn)翹尾，怎么處理?

答：如果是個(gè)別單一通道翹尾，不管是FAM還是VIC通道，首先按照要求復(fù)查，復(fù)查建議重新采樣。

如果不方便重新采樣建議對(duì)原有樣本進(jìn)行重新提取核酸驗(yàn)證，如果復(fù)查陰性判讀陰性，如果復(fù)查還是同一通道翹尾，就要對(duì)結(jié)果仔細(xì)審核。

一是要排除實(shí)驗(yàn)室污染，二是要對(duì)病人信息了解清楚，從臨床癥狀及接觸史排查，如果沒法確認(rèn)，建議必須重新采樣復(fù)查，如有必要可以采用另一家試劑來驗(yàn)證。

如果出現(xiàn)大量的弱陽性擴(kuò)增翹尾，首要原因是考慮實(shí)驗(yàn)室污染，可以通過做環(huán)境樣本和陰性對(duì)照做驗(yàn)證排除。

2、N基因和1ab基因是新冠病毒的特有基因嗎，靈敏度哪個(gè)更高?是否會(huì)和其他冠狀病毒片段重疊?

答：N基因跟1ab都是特異的，不會(huì)跟其他呼吸道病原體交叉反應(yīng)。設(shè)計(jì)時(shí)候，兩個(gè)基因的序列不一樣，導(dǎo)致靈敏度不一樣，N基因的靈敏度比1ab靈敏度高。

3、新冠檢測(cè)結(jié)果和臨床診斷不符合，怎么解讀?

答：新冠病毒由于是RNA病毒，容易降解，另外檢測(cè)結(jié)果也和取樣，核酸提取以及樣本本身的核酸濃度有關(guān)，需要逐一分析，同時(shí)可以結(jié)合臨床癥狀判讀。

4、采用生理鹽水做陰性對(duì)照，內(nèi)標(biāo)也會(huì)增長(zhǎng)，怎么解釋?

答：因?yàn)樵噭┎捎玫氖莾?nèi)源性內(nèi)標(biāo)，內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)是用人源基因標(biāo)記，此基因存在于人的表皮細(xì)胞內(nèi)，操作過程中就可能會(huì)出現(xiàn)人源性的污染，另外環(huán)境污染也有可能導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)增長(zhǎng)，這也是前面提到的建議做環(huán)境樣本質(zhì)控。

5、新冠樣本內(nèi)標(biāo)不出如何處理?

答：如果新冠樣本內(nèi)標(biāo)不出，該樣本必須復(fù)查，可重新混勻該樣本提取核酸，如果重新提取該樣本內(nèi)標(biāo)還是不出，在排除提取問題的情況下，說明采樣不合格，要通知臨床重新采樣復(fù)查。

6、采集環(huán)境樣本檢測(cè)新冠狀病毒，為啥大部分樣本內(nèi)標(biāo)不出，偶爾個(gè)別樣本檢測(cè)出內(nèi)標(biāo)?

答：因?yàn)樾鹿谠噭z測(cè)的是人內(nèi)源性內(nèi)標(biāo)，環(huán)境樣本一般不含有人源細(xì)胞，所以檢測(cè)不出內(nèi)標(biāo);偶爾檢出內(nèi)標(biāo)，可能該環(huán)境樣本上有人源性細(xì)胞粘附，故而檢出內(nèi)標(biāo)。